熒光共定位分析是對細(xì)胞中兩種帶有熒光標(biāo)記的蛋白、細(xì)胞器或者藥物、納米材料等之間的空間相互位置關(guān)系進行分析，以確定它們是否定位于同一區(qū)域或存在相關(guān)性，在細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、醫(yī)學(xué)、植物學(xué)等研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。
最直觀最簡單的共定位分析就是直接看不同顏色的熒光之間是否重疊，比如蛋白A標(biāo)有綠色熒光，蛋白B標(biāo)有紅色熒光，如果蛋白A和B共定位則綠色紅色疊加顯示為黃色（圖1）。只是這種方式無法提供準(zhǔn)確的定量結(jié)果，已無法滿足科研工作者越來越高的要求。所以我們需要可以提供量化結(jié)果的更專業(yè)的共定位分析。
LAS X軟件作為Leica顯微成像系統(tǒng)的搭載平臺，不僅能夠提供完美的成像質(zhì)量，而且整合了眾多高級應(yīng)用并具有強大的后期數(shù)據(jù)處理分析功能，包括FRAP功能、FRET功能，圖像2D、3D測量與自動分析功能，當(dāng)然也有共定位分析功能Colocalization analysis，且操作非常簡單，下面我們就來看看徠卡的共定位分析怎么做吧！
1 進入Quantify
2 在Tools中選擇Colocalization
共定位分析是對兩個熒光通道之間進行分析，所以對于通道數(shù)多于兩個通道的數(shù)據(jù)，需要先確定分析哪兩個，把暫不分析的通道點灰，即可得到共定位結(jié)果及散點圖。
散點圖Cytofluorogram：兩熒光通道中熒光信號的空間分布和熒光強度的二維散點圖，如x軸為綠色信號，y軸為紅色信號，根據(jù)每個像素點中紅綠兩種熒光信號灰度值得到其在圖中的坐標(biāo)，展現(xiàn)分子共定位和相互作用程度。
3 Statistics里面即顯示共定位分析結(jié)果：Pearson's Correlation，Overlap Coefficient，Colocalization Rate等。既可以對整張圖進行分析，也可以使用區(qū)域選擇工具圈出感興趣區(qū)域ROI進行分析。
4 Parameters 為了得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，可以進行相關(guān)的參數(shù)設(shè)置。
ThresholdCh 1& ThresholdCh 2：灰度值低于設(shè)定閾值的像素不納入共定位分析范圍
Background Ch 1 & Background Ch 2：灰度值低于設(shè)定閾值的像素作為背景不納入共定位分析范圍。
也可以使用區(qū)域選擇工具在散點圖中圈出共定位分析的灰度值范圍。
共定位結(jié)果的精準(zhǔn)度與圖像的分辨率密切相關(guān)。但由于衍射極限的存在，常規(guī)共聚焦光學(xué)分辨率只有200nm左右，如果是觀察大于200nm的結(jié)構(gòu)當(dāng)然輕松，也很容易就能準(zhǔn)確判斷其共定位程度，但細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞器、蛋白結(jié)構(gòu)等尺寸往往更小，我們?nèi)绻枨蟾珳?zhǔn)的結(jié)果就需要選擇與之匹配的超高分辨率成像技術(shù)：如達到120nm的高分辨率LIGHTNING技術(shù)，達到30~50nm的超高分辨率STED技術(shù)（圖2）等。隨著分辨率的提高我們可以看到的結(jié)構(gòu)越來越精細(xì)，得到的共定位結(jié)果當(dāng)然越來越準(zhǔn)確。所以在進行共定位實驗時我們可以盡量選擇更高分辨率的成像方式。
此外在樣品準(zhǔn)備和采圖時：
1) 串色會嚴(yán)重干擾到共定位結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以實驗時可盡量選擇串色較少的染料組合以避免串色帶來的干擾；如果選擇的染料串色，采圖時也可以優(yōu)化調(diào)節(jié)檢測范圍以排除串色干擾，當(dāng)然也可以使用序列掃描的方式。
2) 采圖時盡量選擇高數(shù)值孔徑的物鏡以獲取最優(yōu)分辨率，同時注意采樣頻率需要滿足Nyquist采樣定理（可通過Optimize xy-Format功能來調(diào)節(jié)format實現(xiàn)），從而得到與最優(yōu)分辨率匹配的pixel size，以避免采樣頻率不足導(dǎo)致的信息丟失，以及采樣頻率過高可能引起的光漂白。
3) 采圖時確保各熒光通道不過曝，盡量獲取信噪比好的圖像。優(yōu)異的原始數(shù)據(jù)是后期定量分析和去卷積處理的最佳保障。
4) 采圖后可進行去卷積處理（如Huygens或者HyVolution中的deconvolution）以獲取信噪比、分辨率更好的數(shù)據(jù)，得到更準(zhǔn)確的共定位分析結(jié)果。
5) 共定位分析有多種分析算法，如Pearson's Correlation，Overlap Coefficient，Colocalization Rate等，每種算法都有各自的特點和最佳適用情況，所以我們需要根據(jù)具體情況來選擇，或者采用結(jié)合多種算法結(jié)果來分析【1】【2】【3】。
最后，祝大家可以輕松愉快地做好共定位分析實驗啦。